刚刚！张锋团队CRISPR基因编辑系统可减少脱靶效应

 　 今日，CRISPR-Cas基因编辑系统的先驱之一张锋教授在《自然》子刊《Nature Communications》发布一项重要进展，报告了第三个可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统：CRISPR-Cas12b。

　　多功能基因组编辑系统CRISPR-Cas的问世，掀起了一场生物技术革命。在科学研究和医疗研发方面，这套基因编辑工具得到广泛应用，以此为基础的基因编辑疗法也展开临床试验，在治疗人类遗传病方面初现潜力。

　　这一系统中的“元老”成员就是我们已经熟悉的Cas9。不过Cas9也并非没有限制，比如切割非靶点序列的脱靶效应就是一个问题。鉴于CRSPR-Cas系统在微生物中广泛存在，科学家们将Cas蛋白的类型范围不断扩大，寻找新秀，例如Cas12a。

▲2017年1月，张锋教授与NIH两位科学家在《Cell》发文，详细归纳了2类CRISPR系统的特点和作用机制（图片来源：参考资料[2]）

　　在与Cas9、Cas12a同属2类CRISPR系统的Cas蛋白中，还有一个富有潜力的成员，就是Cas12b（过去被称为C2c1）。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，因此更容易通过病毒载体实现细胞间递送。

　　虽然有这样的优势，Cas12b的开发却遇到了一个阻碍。性能最佳的Cas12b来自一种嗜酸耐热菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），但它作为DNA裂解酶的最佳活性需要高达48℃。也就是说，如果放进哺乳动物细胞内，达不到这种Cas12b的温度要求，酶活性就不能发挥。怎么“解锁”这种Cas蛋白呢？

▲Cas9、Cas12a、Cas12b三种核酸酶的基因序列模式图和蛋白质结构示意图（图片来源：参考资料[1]）

　　为了适用于人类基因组编辑，张锋教授和同事们首先在Cas12b蛋白家族中寻找喜欢常温的成员。最终，根据同源序列比对，他们从一种叫作外村尚芽孢杆菌（Bacillus hisashii）的细菌中鉴定出了在人体体温（37℃时）能保持核酸酶活性的BhCas12b。并且，研究人员还通过调整指导RNA（sgRNA）的结构，让Cas12b的效率得到大幅提升。

　　可是，新的问题来了。体外切割实验发现，原始结构的Cas12b在DNA双链断裂时会切割非靶标单链，并且温度越低，这种错误发生得越多。为了解决这个问题，研究者对Cas12b进行了工程改造。根据蛋白质晶体结构的线索，研究人员通过4个点突变，得到了重新设计的新Cas12b，让酶的活性位点更容易和DNA靶序列接近。

　　经过重新设计的Cas12b，基因组编辑的潜能如何呢？在细胞培养实验中，研究人员针对多个基因的多个靶序列考察了Cas12b的编辑效率。对随机引入插入缺失的分析结果显示，新的Cas12b的编辑效率与Cas9和Cas12a相当、甚至更高，足以在人体细胞中作为可编程的基因组编辑工具。

　　除了有效性，特异性对于一款强大的基因组编辑工具来说也非常重要。这一点，研究团队也在人类细胞中利用GUIDE-seq技术对全基因组范围内的脱靶效应进行了检测。结果表明，相比常用的Cas9，Cas12b导致的错误插入缺失都要少得多，脱靶性显著降低。

▲GUIDE-seq分析显示，重新设计的Cas12b没有出现Cas9那样的脱靶效应（图片来源：参考资料[1]）

　　研究团队相信，在继Cas9和Cas12a之后，改造的Cas12b将以其分子量小和靶向特异性高的两大特点，成为又一款在体编辑人类基因组的有力工具。并且，这一显著提升Cas12b效率的改造工程也为解锁更多CRISPR工具提供了富有启发的指导。

　　我们再次祝贺张锋教授团队给CRISPR领域带来的新突破！